博九彩票

招聘服务

Products

产品中心

联系我们
Contact us

more
首页>公司动态>ELISA成功秘笈

新闻中心 News Center

ELISA成功秘笈

点击次数:284 发布时间:2018-04-19

ELISA 作为经典的免疫检测方法,看起来很平常,然而真正做好它并不容易。有哪些秘笈,让上海仁捷生物 的 ELISA 专家告诉你:

1. 确定您的样本类型和试剂盒可以兼容

常见样本类型有血清,血浆,细胞培养上清,如果是厂家实验验证过的,可根据产品说明购买使用。【注意:血浆制备用到的抗凝剂有 EDTA、柠檬酸盐、肝素等多种,相应的血浆性质存在差异,需单独确认兼容性】。

 

特殊样本,如尿液、胸腹水、脑脊液、灌洗液、泪液,组织匀浆液等,可能缺乏厂家数据支持,这并不是说试剂盒无法应用于这些样本,而是需要咨询有相关经验人士或自行实验验证可行性(如需进行掺入回收实验)。

 

2. 试剂盒检测范围需要匹配样本中标志物浓度

ELISA 试剂盒的定量检测范围需参考标准曲线,在标准曲线zui低和zui高浓度区间内属于线性范围,其中的值是可信和可定量的。浓度高于线性范围的样品要稀释到线性范围内来测量,而浓度低于线性范围的样品,其测量值不能用于计算浓度,只能用做参考。有一种常见的相关情况是:健康人样本中很多标志物的浓度偏低,测量值低于标准曲线zui低值。

 

3. 样本收集有讲究

以血清为例,样本收集可参考试剂盒说明书,但需注意以下要点。样本尽量用无菌管收集,避免细菌的酶类和代谢产品对结果的影响。采集过程要避免溶血,因为红细胞溶解释放的活性物质可能会影响检测。保存过程中如有沉淀,应离心后取上清液。样本若不立即测定,建议按照每次使用量分装保存在 -20℃,每次检测使用一管,即避免交叉污染和反复冻融,有能保证检测结果的平行可比性。

 

4. 实验前要准备好相应试剂

提前将所有试剂平衡到室温环境,这个过程大致需半小时左右。洗液是浓缩液,如有结晶析出,需完全溶解后再进行稀释。A、B 两管显色底物在使用前15分钟按 1:1 配成混合液。为保证蛋白标准品溶液配制质量,蛋白标准品为冻干粉,重溶前需将管子离心,加入说明书指定的缓冲液,慢速在摇床上摇匀或颠倒混匀,至少 15 分钟,不建议用枪头吹打。溶解后如需保存,按每次使用量分装后根据说明书要求的温度保存。梯度稀释蛋白标准品时,建议用聚丙烯管(对蛋白吸附力很低),每步都要充分混匀且更换新枪头,确保梯度准确性。

 

5. 仪器设备的准备也必不可少

相关设备包括移液器、洗板机/摇床和酶标仪。移液器的准确性对于ELISA实验结果的可靠性十分关键,需要确保定期校准维护。摇床的使用是为了让反应体系快速达到平衡,获得稳定、可重复的结果。不用摇床对实验通常的影响是,OD 值低,CV 大。酶标仪等设备使用前提前 15 分钟开机预热。

 

6. 预实验:通常预实验包括全部标准曲线和小量样本。

预实验有两个主要目的,一来是熟悉实验流程,发现可能忽略的问题;二来是测试样本和试剂盒是否匹配,一旦出现不匹配的情况,不至于浪费过多样本。另外是对样品中目的分析物的丰度作一下大致了解,以确定合适稀释度。

 

7. 剩余的试剂盒材料要妥善保存

标准品分装后按说明书要求的温度保存,这样可以避免污染,对要求冷冻保存的标准品还可以避免反复冻融;酶标板放回锡箔纸袋,加入干燥剂,封紧封口,4℃保存。忌未将酶标板完全平衡至室温,就放回锡箔纸袋,因为此时由于温度差,酶标板上会有水汽,不利于稳定保存。

 

8. 加样要快速准确,避免气泡

加样时间宜控制在 15 分钟内。加样前要将样本混匀,特别是冻存后融化的样本(自然融化的血清等样本会有分层现象),应上下颠倒充分混匀,注意动作轻缓,避免产生气泡。如冻存融化后的样本有沉淀,可以再次离心。整个加样过程都要注意避免产生气泡。气泡会影响蛋白的相互结合,而影响反应进行。

 

9. 孵育时要保证温度均匀,防止挥发变干

孵育时压紧封口膜。多块板一起实验时,要平放各板,不要叠放,以免因温度不均造成漂移或边缘效应。

 

10. 洗板机的应用

使用洗板机,不但可以降低劳动强度,而且有利于保证 ELISA 测试的稳定性。目前的全自动洗板机不但具有很多实用的洗涤动作,如底部冲洗,两点吸液,震动,交叉吸液;还可以根据需要调节冲洗压力,冲洗距离,冲洗时间等参数。通过优选这些动作和参数,能保证良好的洗涤效果。洗板机的性能对于结果准确性影响也很大,好的洗板机要保证洗板后的残留液尽可能的少,一般不超过 2μL,以洗涤后用人工拍板垫纸不湿为准。应定期检查抽吸针头是否堵塞。洗液如果含有吐温,应随用随配。

 

11. 手动洗板的操作指南

加洗液要快速,没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制,以免被其他试剂污染,或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板,选用无粉尘和碎屑的优质吸水纸。需要用力拍板,使孔内没有可见液体挂壁;但也不能太重,不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。

 

12. 显色反应的关键点

ELISA 实验是个酶促底物显色反应,随时间增加,显色变深,所以选择zui佳时间终止反应是得到准确的标准曲线和样本浓度的重要因素。终止过程要完全。使用的 TMB 底物时完全终止点是黄色,不会有任何程度的蓝色或绿色,终止过程中必要时可以震荡 96 孔板,或用枪头抽吸混匀(终止液含强酸,避免腐蚀)。

 

13. 数据分析

按照说明书推荐的数据分析方法做曲线拟合及分析。说明书中的标准曲线是在厂商的实验室中,由非常有经验的操作人员得到的结果。客户的标准曲线和说明书中的标准曲线可能存在不同,但不等于不好。通常判断标准曲线合格的标准为:背景OD 值 <0.2;zui高点 OD 值>1.0;相关系数 R2 接近或等于 1。只要满足这些条件的标准曲线都是可以使用的。

 

结语

当您了解并掌握了 ELISA 实验的这些独门秘笈,离做出zui棒的 ELISA 就只有一步之遥了,接下来不妨到 上海仁捷生物业界金标准的 ELISA 试剂盒中挑选一款适合您的产品,去获得稳定可靠的实验数据喽。

返回

网站首页/关于我们

新闻动态/技术文章

产品中心 /荣誉与资质

在线留言/联系我们

白介素6(IL6)ELISA试剂盒(种属:鱼)

鸡膜联蛋白A5(ANXA5)ELISA试剂盒

鸡免疫球蛋白M(IgM)ELISA试剂盒

小鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISA试剂盒

小鼠5羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒

小鼠载脂蛋白A4(apo-A4)ELISA试剂盒

小鼠孕激素/孕酮(PROG)ELISA试剂盒

小鼠纤连蛋白(FN)ELISA试剂盒

小鼠维生素D2(VD2)ELISA试剂盒

小鼠维生素C(VC)ELISA试剂盒

小鼠维生素B12(VB12)ELISA试剂盒

小鼠维生素A(VA)ELISA试剂盒

联系地址:上海市杨浦区铁岭路32号1519-10室

固定电话:021-60346444

移动电话:17302193538

在线客服
电话
021-60346444
手机
17302193538
友情链接:好彩头彩票官网  盛源彩票官网  全民彩票平台  盛源彩票官网  大赢家彩票  全民彩票  盛源彩票官网  

免责声明: 本站资料及图片来源互联网文章,本网不承担任何由内容信息所引起的争议和法律责任。所有作品版权归原创作者所有,与本站立场无关,如用户分享不慎侵犯了您的权益,请联系我们告知,我们将做删除处理!