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原装进口elisa试剂盒实验操作的注意事项

点击次数:87 发布时间:2019-05-27

   原装进口elisa试剂盒实验操作的注意事项
  一、ELISA操作前准备工作
  原装进口elisa试剂盒的选择
  ELISA操作前,应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的原装进口elisa试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。
  样本处理
  在收集标本前需有一个完整的计划,需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测,对收集后当天就进行检测的标本,及时储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本,请取材后,将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差,蛋白极易降解,直接影响实验质量,所以避免反复冻融。
  二、ELISA标准品溶解
  标准品是原装进口elisa试剂盒的检测抗原的一个度量标尺,因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节:冻干标准品溶解按照说明书的要求,准确复溶。在冰上操作标准品为佳,静止5-10分钟,轻轻摇匀后按照一次量分装,在-20度或-70度保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备,如离心管的准备和编号以及稀释液的准备;稀释时,应充分混匀;采用进口或者硅化的EP管,减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时,注意操作规范,枪头勿刮划预包被的孔底。
  三、ELISA操作中的洗涤
  洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作,也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象,实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管,还是洗板机,严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象,请比照“手工洗板小贴士”操作:
  a)洗液不要溢出孔外,以免污染相邻的孔,特别是每次洗板的前两遍,若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定会增高。
  b)特别注意:设计实验的时候要考虑实验孔的位置,保证甩掉洗液时,空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开较好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
  c)用干净的滤纸,不要用卫生纸,因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底,导致洗板不干净,结果偏高或偏低,重复孔的数值也会相差很大。
  d)每次拍板不要重复在一个地方拍,特别是洗去酶的步骤;拍板不宜过轻,否则拍不干净,拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重,以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下,最后一次一定要扣干净。
  e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短,洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。
  四、ELISA的标准曲线如何拟合?
  一般情况按照说明书推荐方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成,也可手动制作。标准曲线呈“S”形曲线,两端趋于水平,中间趋于线性,中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量,此时标准品已饱和,再增加标准品的量,其OD值不再变化,故当标准品达到一定浓度后,曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围,根据标准曲线,可以测出样本的浓度。按照科学分析方法,如果存在“奇异点”或者“污点”,直接采用线性分析不是很好,要对拟合标准曲线的几个点进行取舍,同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。

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