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人五型腺病毒抗体(ADV-5-Ab)试剂盒(ELISA)检测步骤

点击次数:396 发布时间:2018-09-26

实验原理

试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人五型腺病毒抗体(ADV-5-Ab)捕获抗原的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人五型腺病毒抗体(ADV-5-Ab)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

 

样本处理及要求

1.  血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.  血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3.  组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

需要而未提供的试剂和器材

  • 酶标仪(450nm)
  • 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
  • 37℃恒温箱
  • 蒸馏水或去离子水

 

试剂盒组成

 

名称

96孔配置

48孔配置

备注

微孔酶标板

12孔×8条

12孔×4条

标准品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

样本稀释液

6mL

3mL

检测抗体-HRP

10mL

5mL

20×洗涤缓冲液

25mL

15mL

按说明书进行稀释

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

终止液

6mL

3mL

封板膜

2张

2张

说明书

1份

1份

自封袋

1个

1个

备注:

1.  标准品浓度依次为:200、100、50、25、12.5、6.25 ng/ml

2.  经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

 

注意事项

  • 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
  • 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
  • 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
  • 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
  • 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
  • 在储存和温育时避免强光直接照射。
  • 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
  • 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
  • 不能使用过期产品。
  • 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。

 

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

 

操作步骤

  1.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
  2.   设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
  3.   样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
  4.   除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
  5.   弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
  6.   每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  7.   每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

 

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。

 

试剂盒性能

  •  检测范围:6.25 ng/ml – 200 ng/ml。
  •  灵敏度:最低检测浓度小于1.0 ng/ml。
  •  特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
  •  重复性:板内变异系数小于10% ,板间变异系数小于15% 。

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